Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002
Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов
Стратегия клонирования генов
Термин «клонирование» происходит от слова «клон», под которым подразумевается генетически однородное потомство клеток или вирусов, т. е. полученных при неполовом размножении. Простейшим примером клона является изолированная колония бактерий на плотной среде. Когда говорят о клонировании гена, имеют в виду тиражирование копии гена в составе векторной молекулы в клетках клона (или вирусных частицах в составе бляшки). При этом каждая клетка клона (каждая вирусная частица в пределах изолированной негативной колонии) будут содержать одинаковые фрагменты чужеродной ДНК. Это очень важный методологический прием, составляющий основу всей генетической инженерии. Ведь при получении генов в ходе расщепления ДНК какого-то организма и включении полученных фрагментов в состав векторов формируется очень сложная смесь молекул, в которой один ген или его сегмент составляет ничтожную часть, так что невозможно изучить ни его структуру, ни свойства продукта. Однако при введении рекомбинантных ДНК (вектор со вставкой) в клетки или вирусные частицы возможность к репродукции в каждой клетке (вирусной частице) приобретает только один тип гибридной ДНК. Выделив клон или содержимое бляшки, можно их инкубировать и получать неограниченное количество клонированных генов, а также их продуктов.
В предыдущем разделе уже описано несколько схем клонирования фрагментов ДНК в составе разных векторов (рис. 20.5—20.7). Обобщая этот материал, следует отметить, что для клонирования генов используют самые разнообразные системы вектор-хозяин. При этом наибольшее распространение получили системы, в которых реципиентными клетками служат бактерии E.coli. Рекомбинантные ДНК вводят в клетки-хозяева или вирусные частицы различными способами.
Для введения в клетки векторов, сконструированных на основе плазмид, используют метод трансформации компетентных клеток или более эффективный способ — трансформацию протопластов (глава 2). Однако такой способ переноса генетической информации характеризуется невысокой частотой (в трансформации участвует ~1 из 500—10 000 молекул ДНК), поэтому для отбора клеток, воспринявших вектор, требуется наличие в его составе специальных маркеров. В качестве таких маркеров чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам, позволяющие производить прямую селекцию трансформированных бактерий на среде с соответствующим антибиотиком.
Векторы, сконструированные на основе вирусов, а также космиды и фазмиды имеют преимущества перед плазмидными векторами в том, что их с высокой эффективностью удается упаковывать в вирусные капсиды in vitro, а затем инфицировать чувствительные клетки. Метод инфекции намного эффективнее трансформации: инфекционной становится каждая десятая молекула ДНК. При этом космиды и фазмиды, попав в клетки, способны поддерживаться в них по типу плазмидной ДНК.
Еще одна задача в процедуре клонирования состоит в отборе клонов, воспринявших именно рекомбинантную ДНК, а не просто векторные молекулы, которые обязательно присутствуют в смеси, полученной при включении фрагментов ДНК в состав векторов. Для решения этой проблемы используют уже описанные приемы, например, инактивацию маркера в процессе вставки. Более прогрессивным способом отбора клонов бактерий или фагов, содержащих векторы со вставками, служит комплементационный анализ с использованием мутантных генов ß-галактозидазы (см. выше). Применение этого метода позволяет отличать клоны бактерий (бляшки фагов), содержащие рекомбинантную ДНК, по цвету при высеве на среду определенного состава. Еще одним подобным примером служит использование гена mel для конструирования плазмидных векторов. Этот ген определяет структуру фермента тирозиназы, катализирующей превращение тирозина в меланин (темная окраска колоний). При вставках фрагментов ДНК в кодирующую область гена mel происходит его инактивация, и трансформированные колонии утрачивают окраску. Существуют и другие приемы для быстрого поиска среди трансформированных или инфицированных клонов тех из них, которые восприняли рекомбинантную ДНК.